Φανταστείτε πως στέκεστε μπροστά από έναν ουρανοξύστη και παρατηρείτε πως η υπέροχη αυτή κατασκευή έχει ένα ελαττωματικό τούβλο που απειλεί την ακεραιότητά της. Η πρόκληση είναι να αντικαταστήσετε το τούβλο χωρίς να τραντάξετε το κτίριο, χωρίς να ραγίσουν οι τοίχοι και χωρίς να φανεί η επισκευή. Δύσκολο; Όχι και τόσο, αν σκεφτεί κάποιος πόσο έχει προχωρήσει σήμερα η τεχνολογία.
Όπως ένα κρυμμένο ελαττωματικό τούβλο σε έναν ουρανοξύστη, το DNA μας μπορεί να ‘κουβαλάει’ ελαττωματικά γονίδια που οδηγούν σε σοβαρές ασθένειες. Η διόρθωσή τους είναι η μεγάλη πρόκληση, και ειδικά η εισαγωγή μεγάλων, υγιών τμημάτων DNA, σε ακριβή σημεία, χωρίς να προκληθεί βλάβη. Είναι σαν να έχει κάποιος έτοιμο το σχέδιο να το κάνει, αλλά να μην διαθέτει τα κατάλληλα εργαλεία-μέχρι σήμερα τουλάχιστον.
Αν ρωτούσε κάποιος τους επιστήμονες ποιο “εργαλείο” γονιδιακής επεξεργασίας θεωρούν σήμερα περισσότερο απαραίτητο από ποτέ για την προώθηση της γονιδιακής θεραπείας, πιθανότατα θα περιέγραφαν ένα σύστημα που τελειοποιείται μέσα στα εργαστήρια των Σάμουελ Στέρνμπεργκ στο Πανεπιστήμιο Κολούμπια και Ντέιβιντ Λιού στο Ινστιτούτο Broad του MIT και στο Χάρβαρντ.
Αυτός ο νέος επεξεργαστής γονιδίων, που ονομάζεται evoCAST, συμβάλλει σημαντικά στην επίλυση ενός προβλήματος που απασχολεί εξαρχής την ανάπτυξη των γονιδιακών θεραπειών. Ποιο είναι αυτό το πρόβλημα; Η προσθήκη μεγάλων, υγιών τμημάτων DNA σε καθορισμένες θέσεις, με ακρίβεια στο ανθρώπινο γονιδίωμα, χωρίς να προκαλούνται ανεπιθύμητες τροποποιήσεις.
Η τελευταία έκδοση του επεξεργαστή, η οποία χρησιμοποιεί φυσικά σύνθετα ένζυμα που βρίσκονται στα βακτήρια, μπορεί να εισαγάγει προγραμματισμένα ένα ολόκληρο γονίδιο ή πολλά γονίδια σε μια συγκεκριμένη θέση στο ανθρώπινο γονιδίωμα με μεγάλη αποτελεσματικότητα, θέτοντας τα θεμέλια για γονιδιακές θεραπείες σε ασθενείς με διαφορετικές μεταλλαγές που προκαλούν γενετικές ασθένειες.
Λεπτομέρειες του επεξεργαστή περιγράφονται σε μια πρόσφατη δημοσίευση στο έγκυρο επιστημονικό περιοδικό Science.
Μια νέα «επανάσταση» στη θεραπεία
Η γονιδιακή θεραπεία έφερε «επανάσταση» στην υγειονομική περίθαλψη με τη διόρθωση ελαττωματικών γονιδίων που προκαλούν ασθένειες. Το «μοριακό ψαλίδι», η τεχνολογία CRISPR-Cas, που εισάγει το σωστό γονίδιο, ανοίγοντας το δίκλωνο DNA, αποδείχθηκε ένα σημαντικό “εργαλείο”. Όμως η διαδικασία έχει αδυναμίες, καθώς υπάρχει η πιθανότητα περιττών τομών του γενετικού υλικού και εισαγωγής γονιδίων σε μη στοχευμένες θέσεις.
Το evoCAST θα μπορούσε να κάνει τη γονιδιακή θεραπεία πιο αξιόπιστη και πιο αποτελεσματική, ιδιαίτερα για ασθένειες όπως η κυστική ίνωση και η αιμορροφιλία, ενώ θα μπορούσε επίσης να επιτρέψει την απλούστερη και ακριβέστερη επεξεργασία γονιδίων σε άλλες ιατρικές και ερευνητικές εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένης της παραγωγής κυτταρικών θεραπειών με CAR -T κύτταρα, καθώς και διαγονιδιακών κυτταρικών σειρών και μοντέλων οργανισμών που απαιτούνται στη βιοϊατρική έρευνα.
Η νέα αυτή προσέγγιση χρησιμοποιεί εργαστηριακά εξελιγμένες εκδόσεις φυσικών ενζύμων που χρησιμοποιούν τον μηχανισμό CRISPR για να μετακινούν μέσα σε βακτηριακά γονιδιώματα μεγάλα τμήματα DNA (τα επονομαζόμενα “Jumping genes”=γονίδια που «πηδούν»), χωρίς να δημιουργούν ελεύθερα θραύσματα διπλής έλικας, που συχνά μπορούν να οδηγήσουν σε ανεπιθύμητα υποπροϊόντα. Ωστόσο, αυτά τα ένζυμα που ονομάζονται CAST ή CRISPR-συσχετιζόμενες τρανσποζάσες, μέχρι στιγμής έχουν δείξει ελάχιστη δραστηριότητα σε κύτταρα θηλαστικών.
Οι εξελιγμένες παραλλαγές CAST που δημιούργησε η ομάδα είναι ικανές να εισάγουν χιλιάδες γράμματα DNA ή ζεύγη βάσεων σε μια θέση-«στόχο» στο ανθρώπινο γονιδίωμα και είναι εκατοντάδες φορές πιο αποτελεσματικές από τα φυσικά συστήματα CAST που έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα.
Τα εξελιγμένα CAST θα μπορούσαν μια μέρα να επιτρέψουν στους ερευνητές να δημιουργήσουν γονιδιακές θεραπείες που να εισάγουν με ακρίβεια ένα ολόκληρο αντίγραφο υγιούς γονιδίου και, ως εκ τούτου, να ωφελούν πολλούς ασθενείς με γενετική ασθένεια, ανεξάρτητα από τη συγκεκριμένη μεταλλαγή που προκαλεί την ασθένεια σε αυτό το γονίδιο.
Μια παλιά ιστορία
Οι ερευνητές στο εργαστήριο του Στέρνμπεργκ, από το 2019 είχαν δει τη δυναμική των CAST που βρίσκονται στα βακτήρια. Ωστόσο, όταν τα εφάρμοσαν σε ανθρώπινα κύτταρα, διαπίστωσαν ότι η επεξεργασία πραγματοποιήθηκε μόνο σε περίπου 0,1% των κυττάρων, μια απόδοση πολύ χαμηλή για μια πιθανή θεραπεία.
Για να αντιμετωπίσουν αυτό το πρόβλημα, οι Λιού και Στέρνμπεργκ συνεργάστηκαν προκειμένου να αξιοποιήσουν τη δύναμη του PACE (Phage Assisted Continuous Evolution), μιας προσέγγισης για την εξέλιξη πρωτεϊνών που είχε αναπτυχθεί στο εργαστήριο του Λιού από το 2011.
Χρησιμοποιώντας το PACE, οι ερευνητές ανέπτυξαν ένα σύστημα CAST από βακτήρια Pseudoalteromonas και μετά από εκατοντάδες γύρους εξέλιξης, ενίσχυσαν την ικανότητά του να εισάγει μεγάλες αλληλουχίες DNA σε συγκεκριμένες θέσεις σε ανθρώπινα γονιδιώματα.
Οι επιστήμονες ισχυρίζονται ότι το evoCast είναι πάνω από 400 φορές πιο αποτελεσματικό σε κύτταρα θηλαστικών από το αρχικό, άγριου τύπου CAST και ότι υποστηρίζει μεγάλα φορτία DNA μήκους άνω των 10 kb. Μπορεί να εισαγάγει μεγάλα τμήματα DNA χωρίς να σπάσει το χρωμόσωμα κατά τη διαδικασία, κάτι που μπορεί να προκαλέσει σοβαρά, ακούσια σφάλματα και μπορεί να το κάνει προγραμματισμένα, κατευθύνοντας τις εισαγωγές σε οποιαδήποτε θέση στο γονιδίωμα καθορίζει ο χρήστης.
Σε ανθρώπινα κύτταρα, το evoCAST εισήγαγε με επιτυχία γονίδια σχετικά με ασθένειες όπως η αναιμία Fanconi και η φαινυλκετονουρία, καθώς και για βελτιωμένη ανοσοθεραπεία με CAR-T κύτταρα με αποδόσεις μεταξύ 10 και 20%.
Η ομάδα εργάζεται επί του παρόντος για την περαιτέρω ανάπτυξη του evoCAST για θεραπευτική χρήση και για την εφαρμογή της καινοτόμου πλατφόρμας CAST-PACE και σε άλλα συστήματα CAST που βρίσκονται στη φύση.
Μια άλλη τεχνική επεξεργασίας γονιδίων που ονομάζεται eePASSIGE , η οποία αναπτύχθηκε πέρσι από το εργαστήριο του Λιού, επιτρέπει επίσης τη στοχευμένη ενσωμάτωση γονιδίων, αλλά ο Λιού λέει ότι το evoCAST προσφέρει συμπληρωματικά πλεονεκτήματα επειδή βασίζεται σε έναν ξεχωριστό μηχανισμό ενσωμάτωσης γονιδίων. Το eePASSIGE είναι γενικά πιο αποτελεσματικό, αλλά το evoCAST διενεργεί επεξεργασία με υψηλή καθαρότητα, εισάγοντας γονίδια σε ένα μόνο βήμα, κάτι που θα μπορούσε να βοηθήσει τους επιστήμονες να το εφαρμόσουν πιο γρήγορα από το eePASSIGE, το οποίο ενσωματώνει νέο DNA σε δύο βήματα, απαιτώντας έναν κύριο επεξεργαστή και ένα ένζυμο που καταλύει τον γονιδιακό ανασυνδυασμό.
Ωστόσο, το evoCAST δεν είναι ακόμη έτοιμο για θεραπευτική χρήση σε ανθρώπους. Οι εμπνευστές του, που υπέβαλαν αίτηση ευρεσιτεχνίας για αυτό, προχωρούν τώρα σε βελτιώσεις του εργαλείου για να φτάσει στο επιθυμητό σημείο. Οι ίδιοι λένε πως παράγοντες όπως το CAST υποδεικνύουν για μια ακόμη φορά την εφευρετικότητα της φύσης στον προγραμματιζόμενο χειρισμό του γονιδιώματος. Η εργαστηριακή εξέλιξη μπορεί να μετατρέψει αυτά τα φυσικά συστήματα σε ισχυρά θεραπευτικά εργαλεία, αν και οι επιστήμονες πιστεύουν ότι μέχρι στιγμής «έξυσαν» λίγο την επιφάνεια αυτού που θα είναι δυνατό στο μέλλον.
